1. 从原代组织中分离细胞 将组织块分离(散)成细胞悬液的方法有多种,最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。

  从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞在酶中的时间要尽可能的短,以保持最大的活性。下列步骤可以解聚整个组织,获得较高产量的有活性细胞。

  ●在去除不需要的组织后,使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4 mm小片,通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀,去除上清液。重复清洗2到3次。

  ●将盛有组织碎片的容器置于冰上,去除残留的上清液。加入0.25%溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶(100 mg组织加入1ml 胰蛋白酶)。

  ●移弃组织碎片中的胰蛋白酶,在37℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。

  ●在组织碎片加入热的完全培养基,用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基,要加入大豆胰蛋白酶剂。

  ●通过无菌不锈钢丝网(100~200 mm)过滤,分散所有剩余组织。计数和接种细胞,进行培养。

  ●用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4 mm小片,用Hanks平衡液(HBSS)清洗组织碎片几次。

  ●通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液,以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚,在碎片中加入新鲜的胶原酶。

  ●用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4 mm小片,用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。

  ●加入Dispase(0.6~2.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液)

  ●通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液,以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚,在碎片中加入新鲜的Dispase。

  2. 从原培养容器中分离细胞:以下是从基层迅速分离细胞,且保持细胞完整性的一般步骤。这一步骤并不意味着对于所有细胞系的广泛应用,每一种系统最佳条件和浓度应该根据经验加以确定。

  (2)使用不包含有钙镁的平衡盐溶液或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸.)清洗细胞(看表确定正确的清洗溶液)。在培养瓶对着细胞的一面加入清洗溶液,通过转动培养瓶1到2分钟清洗细胞层,然后去除清洗液。

  (3) 以2~3 ml/25 cm2的量,加选择的分离液(见表)到培养瓶对着细胞的一面。确保分离液覆盖细胞层。在37℃孵育培养瓶,轻轻摇动培养瓶。通常,在5到15分钟内,细胞就会脱落。细胞分离需要的时间因细胞系不同而有所变化。仔细监测细胞分离过程,避免细胞受损伤。对难于从培养瓶基层分离的细胞系,可以轻轻敲打,以加速分离过程。

  (4)当细胞完全分离时,垂直放置培养瓶,让细胞流到培养瓶的底部。在培养瓶中加入完全培养基,通过移液管在单层细胞表面反复吹打来分散细胞。计数并再次培养细胞。

  (5)对于无血清培养基,加入大豆胰蛋白酶剂。通常使用1∶1(v∶v)0.25 mg/ml胰蛋白酶剂到胰蛋白酶中将胰蛋白酶活性。

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